冰凍切片DAB顯色原位雜交實驗步驟

　　1.組織固定：組織取出PBS漂洗后立即放入原位雜交固定液(動物)中固定12h以上，4°保存運輸。

　　2.脫水：固定后在通風櫥內切取目的區(qū)域組織塊約3mm厚，放入15%蔗糖溶液中8h，后換30%蔗糖溶液中過夜。

　　3.冰凍切片固定：冰凍切片室溫晾干，置于原位雜交固定液(動物)固定10min，于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

　　4.修復及消化：根據(jù)組織類型，固定時間長短及指標的定位，選用不同的修復液進行修復，具體修復條件見上表。自然冷卻后組化筆畫圈，根據(jù)不同組織不同指標特性，滴加蛋白酶K(20ug/ml) 37°消化，消化時間見上表。純水沖洗后PBS洗3次，每次5min。

　　5.阻斷內源性過氧化物酶：滴加3%甲醇-H2O2，室溫避光孵育15min，將玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

　　6.預雜交：滴加預雜交液，37°C孵育1h。

　　7.雜交：傾去預雜交液，滴加含探針雜交液, 恒溫箱雜交過夜。雜交條件見上表。

　　8.雜交后洗滌：洗去雜交液，2×SSC，37°C 洗10min，1×SSC，37°C洗2×5min，0.5×SSC室溫洗10min。若非特異雜交體較多，可以增加甲酰胺洗滌。

　　9.血清封閉：滴加封閉血清正常兔血清 室溫孵育30min。

　　10.滴加HRP標記鼠抗digaoxin抗體(anti-DIG-HRP)：傾去血清封閉液，滴加anti-DIG-HRP。37° 孵育50min，后PBS洗4次×5min。

　　11.DAB顯色：切片稍甩干后，在圈內滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下控制顯色時間，陽性為棕黃色，純水沖洗切片終止顯色。

　　12.復染細胞核：蘇木素染液復染3min左右，自來水洗，蘇木素分化液分化數(shù)秒，自來水洗，蘇木素返藍液返藍1min，流水沖洗。

　　13.脫水封片：將切片依次放入75%酒精6min-85%酒精6min—100%酒精I 6min—100%酒精II 6min-正丁醇6min—二甲苯透明，將切片從二甲苯中拿出稍晾干后，封片劑封片。

　　14.顯微鏡檢，圖像采集分析。

　　術原理介紹

　　采用digaoxin標記特異性的寡核苷酸序列作為探針。利用HRP(過氧化物酶)標記的抗digaoxin抗體與digaoxin標記的核酸雜交體結合。然后HRP催化DAB(二氨基聯(lián)苯胺)生成不溶于水的棕黃色產物，實現(xiàn)靶基因-探針雜交體的定位和定量。

　　本產品僅供科研用途，不用于臨床診斷!

　　注：以上資料僅供參考!

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